第一位挑战者是帕多瓦大学年轻的外科和解剖学教授维萨留（1514-1564年），他有幸在一位法官的支持下，获得囚犯的尸体，进行解剖，从而发现了与盖仑的动物解剖的不同之处。他用溶解的蜡注入各种动物的脑室，制作脑室模型，进行比较，并没有发现多大差别，不足以说明动物之间在智力水平上的悬殊差异。
相反，他却发现高等动物的大脑的相对体积和重量都大得多，从而否定了盖仑的“灵气学说”和异网-脑室中心论。他把这些发现和结论写入《论人体的脑白体》“on-cora”，请自己的老师，顽固的盖仑主义者希尔威乌斯为该书写《序言》时，却遭到了严厉的训斥。
而在人体解剖方面，因为在罗马人统治的时期，人体解剖是严格禁止的，这一点即使是当其时的盖伦已经成为罗马人的宫廷医师都无法忽视这一点。所以在很多方面而言，将人体解剖学的发展错误归咎于盖伦身上，是很无理的想法。
但是毫无疑问，盖伦是一个伟大的医术大师，他还对植物，动物和矿物的药用价值作了比较深入的研究，在他的药物学著作中记载了植物药540种，动物药物180种，矿物药物100种，在药物的研究上也卓有成效。
而后世认为，盖伦的最重要成就是他建立了血液的运动理论和对三种灵魂学说的发展。大约在公元前5世纪后期毕达哥拉斯学派的非罗劳斯认为人体具有三种灵魂，即（一）生长灵魂，这是人、动物和植物所共有的，在人体它位于脐部；(二）动物灵魂，这是人和动物所共有的，它位于心脏、主管感觉和运动；(三）理性灵性灵魂，这只有人才具备，位于脑部，主管智慧。亚里士多德则分别称这三种灵魂为生殖灵魂、感觉灵魂及理性灵魂。植物只有生殖灵魂，动物有前二种灵魂，只有人才具备三种灵魂。盖伦则把这三种灵魂的说法与人体的解剖学、生理学知识创造性的结合起来，提出了所谓“自然灵气“、“生命灵气“、“动物灵气“的理论。他认为这三种灵气，在人体分别位于消化系统、呼吸系统和神经系统。它们都发源于一个被称之为“纽玛“的中心灵气。这种“纽玛“存在于空气中，人体通过呼吸，吸进“纽玛“从而获得活动。
盖伦认为肝是有机体生命的源泉。是血液活动的中心。已被消化的营养物质由肠道被送入肝脏，乳糜状的营养物在肝脏转变成深色的静脉血并带有自然灵气。带有自然灵气的血液从肝脏出发，沿着静脉系统分布到全身。它将营养物质送至身体各部分，并随之被吸收。肝脏不停地制造血液，血也不地被送至身体各部分并大部分吸收，而不作循环的运动。盖伦认为心脏右边是静脉系统的主要分枝。从肝脏出来进入心脏右边（右心室）的血液，有一部分自右心室进入肺，再从肺转入左心室。
另有部分盖伦以为它可以通过所谓心脏间隔小孔而进入左心室。流经肺部而进入左心室的血液，排除了废气、废物并获得了生命灵气，而成为产颜色鲜红的动脉血。带有生命灵气的动脉血，通过动脉系统，分布到全身，使人能够有感觉和进行各种活动，有一部分动脉血经动脉而进大脑，在这里动脉血又获得了动物灵气，并通过神经系统而分布到全身。盖伦认为血液无论是在静脉或是动脉中，都是以单程直线运动方法往返活动的，它犹如潮汐一样一涨一落朝着一个方向运动，而不是作循环的运动。
盖伦在描述性生物学方面作出了重要贡献，他对人体许多系统解剖结构的系统描述以及结合解剖构造对血液运动的系统论述，都在生物学史上产生了很大的影响。在哈维建立血注入循环理论之前，他的血液运动理论一直为西方学者所信奉。但是在盖伦的论述中也有许多错误，例如他所说的心间隔上有小孔，血液能通过小孔，往返于心脏左右两边。这纯是他的猜测，实际根本不存在。盖伦的许多解剖学和生理学都是建立在错误的结论基础之上的。人们后来发现，盖伦的某些错误之所以产生，是由于他所进行的解剖对象是动物，主要是狗而不是人。他的生理描述往往是脱离了实际，而屈从于宗教神学的需要。后来人们为消除他在解剖学、生理学上的错误影响，曾进行了艰苦的斗争。
被誉为“现代医学之父”的英国医生威廉?哈维（1578-1657年）。由于受到老师发现静脉瓣的启发，而投身血液循环的研究。通过捆绑臂部中断血流，而发现动脉和静脉的血液流向相反；测量动脉和静脉的血流量时，发现如此巨大的血流量不可能被静脉末端的组织完全吸收；并且发现了肺的血液循环，因而提出封闭式“血液循环”的观点，否定了盖仑的血液往返流动的学说。
他在1628年发表了《动物的心脏和血液的运动》“-and-blood-in-animals”，宣布了自己的发现和理论，却被诬为“精神失常”的医生，直到1657年死后，才被后人证实和接受。
盖伦提出了气质这一概念，用气质代替了希波克拉底体液理论中的人格，形成了4种气质学说，此分类方式一直在心理学中沿用至今。
直到16世纪盖伦在欧洲是一个医学权威。在这之前的绝大部分医学学者不对实物进行观察而相信盖伦已经描述了一切可以描述的事物。放血疗法成为